Диагностика методом ПЦР: современный подход выявления инфекционных и генетических заболеваний

Полимеразная цепная реакция, также известная как ПЦР, является сложной диагностической технологией, способной обнаруживать инфекционные и вирусные заболевания. Подробнее о том, чем является ПЦР-диагностика, какими преимуществами она обладает и какие этапы проведения ее включает, мы расскажем в этой статье.

В частности, ПЦР-диагностика основывается на увеличении количества конкретной ДНК-части в образце, что позволяет ее определить в микроскопических количествах. Это обеспечивает высокую точность диагностики даже в случае незначительной концентрации заболевания.

Одним из главных преимуществ ПЦР-метода является его высокая чувствительность и специфичность, которые существенно повышают точность результатов тестов. Кроме того, ПЦР-диагностика может быть использована для обнаружения нескольких заболеваний одновременно, что экономит время и средства.

Этапы проведения ПЦР-диагностики включают подготовку образцов, извлечение и очистку ДНК, смешивание ДНК с реактивами, увеличение количества ДНК в циклах и анализ полученных результатов.

Таким образом, ПЦР-диагностика является перспективной и эффективной технологией, которая значительно облегчает задачу постановки диагнозов инфекционных и вирусных заболеваний. Ее преимущества и этапы проведения делают ее достойной конкурентом традиционных методов диагностики.

Описание ПЦР-диагностики: что это такое?

Сегодня ПЦР-диагностика, которая появилась более 30 лет назад, является одним из наиболее точных способов обнаружения инфекций. В такой диагностике используется метод, основанный на принципе многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. При этом производится амплификация, то есть простое увеличение числа копий молекулы ДНК, которая присутствует только у определенного вида патогенного микроорганизма, который интересует врача. Этот процесс происходит под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) и в результате сложного процесса образуется две молекулы ДНК из одной.

Цикл процесса образования новой молекулы ДНК занимает около 3 минут, и необходимое для достоверного визуального определения количество молекул получается после тридцати-сорока циклов.

С помощью ПЦР также можно производить различные манипуляции с генетическим материалом, такие как сращивание фрагментов ДНК, ввод мутаций и т.д. Использование ПЦР возможно не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для выделения новых генов и установления отцовства.

Эта диагностика проводится в специальных лабораториях, где используется амплификационное оборудование. Существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии, где используется не только ДНК, но и фрагменты рибонуклеиновой кислоты (РНК). Некоторые из этих модификаций не требуют специального оборудования, а амплификация осуществляется при постоянной температуре.

Одна из таких модификаций - «горячий старт ПЦР», которая подразумевает предварительное прогревание пробирок с амплификационной смесью при температуре 95°С в течение 3–5 минут, чтобы исключить клонирование неспецифических ДНК-фрагментов.

Одна из популярных модификаций ПЦР - мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследования сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Поэтому, она ускоряет и удешевляет анализ, при этом увеличивает точность исследования методом ПЦР.

ПЦР-диагностика - метод анализа, широко используемый в клинической медицине для выявления различных заболеваний. Данный метод имеет множество сфер применения, среди которых можно выделить следующие:

В урогинекологии

Метод помогает выявлять инфекционные заболевания, слабо проявляющие свои симптомы и имеющие хронический характер. ПЦР-диагностика позволяет определять наличие половых инфекций, таких как хламидиоз, микоплазма, уреаплазма, трихомониаз, гарднерелла, кандида, гонококк и трепонема. Кроме того, данный метод позволяет детектировать группу вирусов, поражающих урогенитальный тракт обоих полов, включая вирус герпеса и вирус папилломы человека. Своевременное выявление и лечение данных инфекций способствует избежанию риска развития злокачественных заболеваний шейки матки у женщин.

В неонатологии

ПЦР-диагностика используется для выявления наличия неонатальных инфекций как на внутриутробном этапе, так и у новорожденных. Данный метод является эффективным при выявлении опасных инфекций, таких как цитомегаловирус, токсоплазмоз, вирусы краснухи и герпеса, хламидии и микоплазмы.

В службе крови

Метод применяется для избежания риска переливания крови или плазмы, инфицированной опасными заболеваниями (ВИЧ, сифилис, гепатиты). ПЦР-диагностика значительно превосходит по точности серологические методы, поскольку метод способен выделить даже те инфекции, которые имеют длительный инкубационный период и не определяются при помощи обычных исследований в течение первых нескольких недель.

В клинике инфекционных заболеваний

Метод помогает выявлять заболевания, такие как гепатит, СПИД, сальмонеллез, хеликобактериоз, холера, бруцеллез, туляремия, дифтерия, токсоплазмоз и другие инфекции.

В фтизиатрии и пульмонологии

ПЦР-диагностика позволяет выявлять возбудителей атипичных пневмоний и рецидивирующих хронических бронхитов, которыми являются хламидии и микоплазмы. Кроме того, данный метод позволяет не только поставить диагноз, но и провести видовую идентификацию возбудителя, выявить конкретный штамм. Также метод ПЦР используется для ранней и высокоточной диагностики туберкулеза.

Другие сферы применения

Следует отметить, что ПЦР-диагностика имеет множество других сфер применения, таких как криминалистика, экспериментальная медицина, создание генетических паспортов, мониторинг состояния окружающей среды, анализ продуктов питания, фармакология и ветеринария.

Переваги ПЦР-діагностики

Незважаючи на те, що ПЦР-діагностика - метод відносно "молодий", вона отримала широке поширення в медичній практиці через переваги, які надає перед іншими методами аналізу:

• Пряме визначення збудника інфекції. Деякі традиційні методи, такі як імунноферментний аналіз (ІФА), виявляють лише білки-маркери, які є продуктом життєдіяльності збудників інфекції, тому вказують на присутність мікроорганізмів лише косвено. Присутність специфічної послідовності в ДНК, виявленої за допомогою ПЦР, без помилок або майже без помилок показує присутність конкретної інфекції.
• Висока специфічність методу. Вона обумовлена тим, що в досліджуваному матеріалі виявляється фрагмент ДНК, характерний лише для конкретного збудника інфекції. Специфічність ісключає можливість помилкових результатів аналізу, тоді як у імунологічних методах досліджень помилки здійснюються же з моною через перехресну реакцію антигенів.
• Висока чутливість. За допомогою ПЦР-діагностики можна виявити присутність в організмі навіть одиничних клітин вірусів або бактерій в тих випадках, коли звичайними методами це майже неможливо зробити. ПЦР виявляє наявність всього 10–100 кліток в пробі, тоді як імунологічними та мікроскопічними тестами можна виявити наявність інфекції при кількості клітин не менше 103–105.
• Універсальність. Схожість складу всіх ДНК або РНК дає можливість використовувати універсальні методи лабораторних досліджень, діагностікуючи відразу кілька збудників з однієї біологічної проби.
• Швидкість отримання результатів. Оскільки для проведення ПЦР-діагностики не потрібен посів та вилучення культури збудника, то і багато часу на неї не потрібно. Весь цикл – від збору біоматеріалу до отримання результатів – займає 4–5 годин.
• Діагностика латентних інфекцій. ПЦР-методом діагностуються складно культивовані і некультивовані форми мікроорганізмів, які відбуваються в тих випадках, коли захворювання перебігає в прихованій формі.
• Визначення збудника інфекції в інших матеріалах. За допомогою методу ПЦР можна виявити збудників інфекції не тільки в організмі людини, але і в грунті, воді, продуктах харчування.

Ограничения ПЦР-диагностики

Несмотря на то, что метод ПЦР-диагностики считается весьма эффективным, у него все же имеются ограничения. Однако их количество настолько мало, что это не может негативно сказаться на популярности и результативности данного метода.

Вероятность амплификации ДНК возбудителя может сохраняться даже после его гибели. При проведении теста для контроля эффективности лечения, необходимо учитывать определенные требования, в частности, проводить его через некоторое время после полного исчезновения возбудителя инфекции в организме – обычно это занимает от 1 до 2 месяцев.

Существует возможность возникновения перекрестной реакции. Праймеры – это фрагменты ДНК, подбираемые на основе знаний о генетической структуре конкретного возбудителя. Теоретически, такой же фрагмент может находиться в геноме других микроорганизмов, генетический код которых еще не расшифрован. Их наличие в тест-пробе может привести к неверному результату анализа.

Микроорганизмы могут изменяться, что может усложнить анализ при помощи ПЦР-диагностики. Иногда возникновение некоторых штаммов возбудителей может не выявляться в результате таких анализов.

В целях снижения рисков возникновения ошибочных результатов разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Метод ПЦР является одним из самых точных для выявления микроорганизмов в биоматериале. Весь процесс диагностики проводится в специальной лаборатории и состоит из нескольких этапов.

Первый этап - забор биоматериала. Это происходит в процедурном кабинете соответствующего профиля. Для исследования используются эпителиальные соскобы со слизистых оболочек, моча, мокрота, кровь, биологические жидкости и биоптаты. При этом необходимо соблюдать правила стерильности и избегать попадания следов крови в материал.

Второй этап - хранение и транспортировка биоматериала. Образцы хранятся при комнатной температуре не более 2 часов. Для длительного хранения пробы помещают в холодильник с температурой 2–8°С на срок не более одних суток или в замороженном виде при температуре -20°С. При транспортировке биоматериала необходимо соблюдать все правила, используя специальные термоконтейнеры или термосы.

Третий этап - выделение ДНК из образца. Для каждого вида образца используется свой метод выделения. Например, для анализа соска эпителиальных клеток используется метод твердофазной сорбции.

Четвертый этап - проведение ПЦР. Некоторое количество образца из биологической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку, где проводится амплификация микроорганизмов. Одновременно проводятся контрольные пробы.

Пятый этап - регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза в присутствии специального вещества. Образец просматривают в ультрафиолетовом свете — наличие светящейся полосы свидетельствует о положительном результате.

Шестой этап - интерпретация результатов исследования. Результаты могут быть положительными или отрицательными. На основании количественного результата можно оценить степень активности заболевания и определить характер лечения.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод диагностики инфекций с различным уровнем ценовой политики в разных клиниках. Стоимость ПЦР-анализа зависит от условий процедуры, включая целевые инфекции, виды анализируемого материала, а также методы тестирования – качественные или количественные. Обычно на определение одной инфекции расходуют от 200 до 800 рублей. Ключевым фактором является также оплата за сбор материала – до 400 рублей. В таблице 1 указана средняя стоимость ПЦР-диагностики различных видов.

Многие медицинские центры предлагают комплексное проведение ПЦР-исследования, в рамках которого сразу происходит несколько анализов. Например, «ПЦР-8» (восемь бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций) – 1400 рублей или «ПЦР-12» (двенадцать половых инфекций) – 3500 рублей. Такая услуга существенно экономит деньги, поскольку отдельный ПЦР-анализ на каждую инфекцию обойдется гораздо дороже.

Фото: freepik.com